Fundacja testowa koagulazy, procedura i zastosowania

Test koagulazy Jest to technika laboratoryjna, która służy do podkreślenia obecności enzymu koagulazy. Ten enzym ma własność osocza koagularnego. Loeb w 1903 roku jako pierwszy opisał ten enzym.

Test ten przeprowadza się do Gram dodatnich kokosów, dodatniej katalazy, umożliwiając szczepy Staphylococcus aureus reszty gronokocci, ponieważ jest on jedynym mikroorganizmem o znaczeniu klinicznym, który to daje.

Oba obrazy ujawniają pozytywny test koagulazy. Źródło: lewy obraz: Philippinjl [CC BY-SA 3.0 (http: // creativeCommons.Org/licencje/by-sa/3.0/]]. Właściwy obraz: Zdjęcie wykonane przez autora MSC. Marielsa Gil.

W tym sensie członkowie rodziny Staphylococaee, którzy dają ten negatywny test, są często nazywani gronkowcem koagulazą negatywną.

Istnieją niektóre odmienne odmienne od S. aureus  które mogą wytwarzać koagulazę, na przykład Staphylococcus schleiferi Spp Coagulans, S. Hyicus, s. Intermedius i s. Delphini.

Jednak pierwsze trzy mają znaczenie kliniczne na poziomie weterynaryjnym i można je rzadko znaleźć jako czynnik przyczynowy ludzkich infekcji, podczas gdy S. Delphini Występuje tylko w środowiskach morskich.

Ponadto różnią się łatwo, ponieważ S. Hyicus I S. Intermedius Nie fermentują mannitolu i S. Schleiferi Spp Coagulans nie fermentuje maltozy, ani Trehalosa, podczas gdy S. aureus Tak, fermentuj te węglowodany.

Obecność enzymu koagulazy została powiązana z wirulencją szczepów.  Jednak teoria ta spadła, biorąc pod uwagę fakt, że zaobserwowane są inne zjadliwe negatywne gatunki koagulazy, zdolne do wytwarzania ważnych infekcji.

[TOC]

Podstawa

Staphylococcus aureus Wytwarza dwa rodzaje koagulazy, jedna, która pozostaje powiązana ze ścianą komórkową, zwaną także czynnikiem aglutynacji lub czynnikiem reaktywnym koagulazy (FRC), oraz pozakomórkowym uwalnianym w uprawach ciekłych. Dlatego nazywane są odpowiednio zjednoczoną koagulazą i wolną koagulazą.

Enzym koagulazy zawdzięcza swoją nazwę produkowanej działaniu. Ma to zdolność przekształcania fibrynogenu w fibrynę, tworząc oczywisty skrzep, gdy jest on w osoczu, to znaczy ten enzym symuluje aktywność trombiny.

W rzeczywistości jedną z najbardziej akceptowanych teorii jest to, że zjednoczona koagulaza reaguje z wolną koagulazą w celu aktywowania czynników krzepnięcia. Ta aktywacja generuje substancję, która działa podobna do tego, jak działa protrombina, tworząc związek z funkcją trombiny.

Może ci służyć: profil tarczycy: funkcja hormonalna, znaczenie, kwantyfikacja

Różnica w stosunku do normalnego wodospadu krzepnięcia polega na tym, że reakcja ta nie wymaga obecności wapnia i nie ma na nią wpływu heparyna.

Aby wykonać test koagulazy, wystarczy stawić czoła świeżym plazie Staphylococcus z najlepiej królika, a tym samym obserwować tworzenie się lub nie skrzepu.

Istnieją specyficzne techniki wykrywania jednocześnie zjednoczonej koagulazy oraz zjednoczonej i wolnej koagulazy.

Niektóre szczepy S. aureus Dają szybszy pozytywny wynik niż inni. Prędkość tworzenia skrzepów jest wprost proporcjonalna do obecnego stężenia koagulazy.

Technika testu koagulazy w slajdzie wykrywa United Coagulas.

Procedura

-Test koagulazy w uchwycie

Materiały

-Oczyść arkusz zjeżdżalni

-Najlepiej można również zastosować plazmę królika, w osoczu ludzkim lub konnym. Plazma można uzyskać komercyjnie liofilizowane i odtworzone, gdy będzie używane lub może być stosowane świeże (niedawno wzięte). Inną realną alternatywą jest zastosowanie fibrynogenu.

-Roztwór soli fizjologicznej (0,85%) sterylny (SSF).

Uzyskanie świeżego osocza

Wyciągnij ludzką lub zwierzęcą krew żylną. Można zastosować dowolne z następujących antykoagulantów: EDTA, szczawian wapnia, heparyna lub cytrynian sodu. Dobrze wymieszaj i wirowanie. Aseptycznie usuń supernatant (osocze), bez czerwonych krwinek i osadzaj się w sterylnej rurce.

Separacja osocza. Źródło: Zdjęcie wykonane przez autora: MSC. Marielsa Gil.

Liofilizowany osocze

Odtworzone, jak określono w fiolce zestawu komercyjnego.

Świeży fibrynogen

Z cytrynowanego osocza wymieszaj osocze z nasyconym roztworem chlorku sodu. Pozwalać.

Odrzuć supernatant, odtworz osad do 5 -krotności jego objętości sterylną wodą destylowaną. Dodaj 5 jednostek heparyny dla każdego ml fibrynogenu. Ratować.

Technika

W zjeżdżalni roztwór soli fizjologicznej i oddzielnie umieszczana jest kropla plazmy. Weźmy z uchwytem platyny 1 lub 2 czystymi kolonami mikroorganizmu, aby spróbować.

Wymieszaj obciążenie bakteryjne w kropli plazmy i powtórz operację w kropli SSF. Zwróć uwagę na wyniki natychmiast. Wynikiem dodatnim będzie ten, w którym tworzenie makroskopowego aglutynowanego (biały osad) obserwuje się po jednej minucie po stronie spadku plazmy.

Może ci służyć: Ekologologia: jakie badania i zastosowania u zwierząt i warzyw

Kropla SSF służy jako kontrola negatywna. Jeśli obserwuje się aglutynację z SSF, oznacza to, że mikroorganizm jest samozlutyną, jest w stanie zapewnić fałszywie pozytywne wyniki. W takim przypadku należy go potwierdzić z testem lampy.

Zaleca się również zamontowanie kontroli pozytywnej ze znanym szczepem S. aureus.   

Interpretacja

Aglutynacja w odległości 5 do 20 seg (silny test pozytywny).

Zmienna aglutynacja między 20 sekundami a jedną minutą (dodatni test opóźniony).

Pewny stopień aglutynacji po minucie (wątpliwy test). Zaleca się powtórzenie testu lub potwierdzenia metodą rurki.

Nie ma aglutynacji (test ujemny).

Wynik z SSF. Musi zawsze dać negatywne, jeśli wynik testu jest automatycznie.

-Test koagulazy rurowej

Materiały

-Sterylna rurka testowa

-Osocze

-Maria Bath w 37 ° C.

Technika

Zmierz za pomocą sterylnej 0,5 ml pipety plazmy i umieść ją w rurce testowej 12 x 75. Załaduj uchwyt platynowy 2 do 4 czystymi kolonii, aby zbadać z uprawy stałej od 18 do 24 godzin i ostrożnie odróżnij go w osoczu, wymieszaj i inkubuj w 37 ° C przez 4 godziny.

Zbadaj rurkę o pierwszej godzinie bez drżania, po prostu delikatnie przechylony. Jeśli nie jest nadal obserwowane skrzep, możesz nadal obserwować co 30 minut do zakończenia 4 godzin. Jeśli po 4 godzinach jest nadal ujemny, można go pozostawić do 24 godzin, ale w temperaturze pokojowej. Obserwuj i zgłaszaj wynik.

Na podstawie doświadczenia niektórzy mikrobiolodzy zalecają stosowanie 500 µl zawiesiny bakteryjnej z 18 -godzinnej uprawy w płynnym pożywce do wykonania testu.

Najwyraźniej oferuje szybsze i bardziej niezawodne wyniki niż wtedy, gdy kolonie z stałych mediów są emulgowane, szczególnie jeśli zastosowano ludzką plazmę uzyskaną z banku krwi.

Zastosowanie szczepów z bulionu pomaga rozcieńczyć możliwą obecność ludzkich przeciwciał przeciwstafilokokowych w osoczu, które mogą hamować działanie koagulazy.

Interpretacja

Jeśli skrzep, który obejmuje całą ciecz (pełną krzepnięcie) lub skrzep, że nic w pozostałej cieczy (częściowa krzepnięcie) nie należy traktować jako testu pozytywnego.

Może ci służyć: gałęzie biologii i czego się uczą

Jeśli nie jest utworzone, to znaczy zawieszenie jest jednorodne, test jest ujemny.

-Test koagulazy za pomocą fibrynogenu

Fibrynogen jest stosowany tak jak plazma i służy zarówno do testu uchwytu, jak i testu lampy. Postępuj zgodnie z opisem dla osocza i interpretuj w ten sam sposób.

Używać

Służy do odróżnienia Staphylococcus aureus ujemnych gronkowców koagulazy.

QA

Mają świeże uprawy obciążenia S. aureus Aby być stosowanym jako kontrola pozytywna. Możesz także mieć obciążenie S. naskórka jako kontrola negatywna.

Ograniczenia

-Pozytywny test nie należy pozostawić inkubacji przez 24 godziny, jak S. aureus wytwarza fibrynolisin, która rozpuszcza skrzep.

-Do niezawodnego testu należy zastosować świeżo lub świeżo odtworzoną plazmę, a także ważne jest, aby stosować świeże uprawy bakteryjne (18–24 godziny). Unika to fałszywych negatywów.

-Test należy przeprowadzić wspólnie z kontrolą negatywną i pozytywną.

-Niektóre stałe media mogą zakłócać test koagulazy. Nie jest to zalecane.

-Jeśli stosuje się cytrynowane osocze, zaleca się umieszczenie 5 jednostek heparyny na ml plazmy, aby uniknąć fałszywych pozytywów. Jest tak, ponieważ niektóre różne mikroorganizmy od S. aureus Mogą rozkładać cytrynian i tworzyć skrzep w osoczu. W takim przypadku wskazane jest wykonanie Grama i testu katalazy.

-W teście lampy ważne jest monitorowanie reakcji co 30 minut, ponieważ istnieją szczepy S. aureus które wytwarzają wysokie stężenie fibrynolisin i rozcieńczą nowo uformowany skrzep. Unikaj fałszywych negatywów.

-Podczas monitorowania testu należy nagle uniknąć rurki, może to zniszczyć początek tworzenia skrzepu, który nie zostanie przywrócony, powodując fałszywe negatywy.

Bibliografia

1. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Diagnoza mikrobiologiczna. Ed. Pan -american Editorial S.DO. Argentyna.
2. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Diagnoza mikrobiologiczna Bailey & Scott. 12 ed. Pan -american Editorial S.DO. Argentyna.
3. Mac Faddin J. (2003). Testy biochemiczne identyfikacji bakterii znaczenia klinicznego. Wydanie trzecie. Pan -american Editorial. Buenos Aires. Argentyna.
4. Laboratoria pro-lab. Królicze koagulowane osocze. Dostępne na: pro-lab.com
5. „Coagulaza." Wikipedia, bezpłatna encyklopedia. Luty 2019, 04:23 UTC. ABR 2019, 15:50 Wikipedia.org.