Elektroforeza podkładowa, technika, do czego jest przykłady

Elektroforeza Jest to technika stosowana do oddzielenia cząsteczek w polu elektrycznym. Musi to zrobić konkretnie z migracją cząstek obciążonych pod wpływem prądu elektrycznego stosowanego między dwoma biegunami, jednym dodatnim i drugim ujemnym.

Elektroforeza jest obecnie jedną z najbardziej rutynowych procedur, które mają miejsce podczas opracowywania eksperymentu, szczególnie w dziedzinach związanych z chemią analityczną, biochemią oraz naukami biologicznymi i medycznymi w ogóle.

Wiadro elektroforezy. Źródło: Melodygar/CC BY-SA (https: // creativeCommons.Org/licencje/nabrzeże/4.0)

Służy do oddzielania białka, peptydów, DNA, RNA i innych w zależności od ich obciążenia, wielkości, gęstości i czystości.

Różne domy komercyjne zaprojektowały różne formaty, z różnymi aplikacjami i odpowiednimi zyskami do określonych celów, jednak wszystkie procedury wymagają tych samych podstawowych elementów:

- Źródło energii do generowania ładunku elektrycznego

- Medium wsparcia separacji

- Rozwiązanie buforowe (bufor) Aby utrzymać pH na stałym poziomie

[TOC]

Podstawa

Elektroforeza jest niczym więcej niż migracja (separacja) cząstek lub obciążonych cząsteczek (naturalnie lub sztucznie) w pożywce lub wsparciu pod wpływem pola elektrycznego.

Technika oparta jest na jednym z głównych fizycznych równań elektromagnetyzmu, zgodnie z którym siła jest równa ładunku elektrycznego pomnożonego przez pole elektryczne przyłożone w tym punkcie (F (siła) = Q (ładunek elektryczny) x E (pole elektryczne (pole elektryczne ).

Zgodnie z tym równaniem dwie cząstki o tej samej masie, ale o różnym obciążeniu, przejdą do różnych prędkości w tym samym polu elektrycznym. Ponadto prędkość ruchu tych cząstek będzie zależeć od związku między ich obciążeniem a masą.

Naukowcy skorzystali z tych właściwości i relacji ładunkowych/masy, aby oddzielić składniki od biomolekuł w swoich najmniejszych częściach, a także do oddzielenia różnych cząsteczek w mieszaninie, między innymi.

Ważne jest, aby pamiętać, że cząsteczki biologiczne, takie jak aminokwasy, peptydy, białka, niektóre węglowodany, nukleotydy i kwasy nukleinowe mają coś, co nazywamy „grupami jonizowanymi”, więc mogą istnieć jako gatunki pozytywne lub ujemnie naładowane w pewnych warunkach pH.

Technika

Chociaż istnieją różne rodzaje elektroforezy, elektroforeza żelowa jest najczęściej stosowana w analizie biochemicznej, biologii molekularnej i biotechnologii, więc będzie o tym krótko opowiedzieć w kategoriach technicznych.

Jak sama nazwa wskazuje, elektroforeza żelowa implikuje zastosowanie stałego podłoża wspornika w kształcie stałego, albo do analizy/oddzielenia mieszanin białka lub kwasów nukleinowych (DNA i/lub RNA) pod wpływem pola elektrycznego pola elektrycznego.

System lub aparat stosowany do wykonywania elektroforetycznego „biegu” może być pozioma (zwykle stosowana do kwasów nukleinowych) lub pionowo (zwykle stosowany do białka).

- Przykład techniki elektroforezy kwasu nukleinowego

Kwasy nukleinowe są zwykle oddzielone przy użyciu żeli agarozowych (polisacharyd galaktozy), który jest przygotowywany z odpowiedniego roztworu buforowego (Tris/Octan/EDTA lub TRIS/BORATO/EDTA) i którego stężenie określi „rozdzielczość” fragmentów różnych rozmiarów rozmiarów.

Może ci podać: Ziemia łańcuch pokarmowy: linki i przykład

przygotowanie próbki

Pierwszym krokiem przed wykonaniem elektroforetycznego przebiegu w żelu agarozowym jest uzyskanie próbki. Będzie to zależeć od końca eksperymentalnego, a próbki mogą być iloczynem trawienia enzymatycznego, od reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR), oczyszczania kwasów nukleinowych itp.

Mieszanka próbki z buflem obciążenia.Org/licencje/według/4.0) Via Wikimedia Commons)

Po uzyskaniu jest to mieszane z kolorowym rozwiązaniem (roztwór obciążenia), który umożliwia szybkie odkładanie próbki w studni, ponieważ ma glicerol i barwnik, który umożliwia uruchomienie wizualnie.

Przygotowanie żelu

Ten krok polega na zmieszaniu niezbędnej ilości podłoża żelującego (agarozy) z roztworem buforowym, topieniem go za pomocą ciepła i utrwalając go na podporę, która działa jako „pleśń”.

Podczas gelifikacji niektóre „grzebienia” są wprowadzane do żelu umieszczonego w „formie”, aby ograniczyć „studnie”, w których próbki zostaną wprowadzone przed przebiegiem.

Po ochłodzeniu i utrwalaniu żelu „Combs” zostaną usunięte i wprowadzane do pojemnika znanego jako „wiadro”, który jest pełen roztworu buforowego (Tris/Acetate/Edta lub Tris/Borato/Borato/Edta).

To wiadro jest z kolei uwzględnione w tak zwanej „komorze elektroforetycznej”, która jest niczym więcej niż pojemnikiem, przez który jest przekazywany pole elektryczne i ma przestrzeń, w której żel jest wprowadzany i dwie sekcje, które są wypełnione Rozwiązanie buforowe (bufor uruchomić).

Ten aparat ma dwie elektrody, jedną pozytywną i jedną ujemną, wśród których ruch jonowy jest wytwarzany po zastosowaniu pola elektrycznego (jest podłączony do źródła zasilania).

Ładowanie próbek

Po zmieszaniu próbek z odpowiednim roztworem obciążenia wprowadzane są one do „studni” wcześniej wykonanych do żelu.

Ponieważ kwasy nukleinowe mają ujemne obciążenie netto, migrują z bieguna ujemnego do dodatniego, więc należy to wziąć pod uwagę, gdy kamera jest podłączona do źródła zasilania, zapewniając, że biegun ujemny odpowiada większości miejsca obok miejsca w miejscu gdzie próbki zostały załadowane.

Czas koryta jest ustanowiony w ścisłej zależności od badacza odpowiedzialnego za eksperyment. Napięcie jest zazwyczaj obliczane w stosunku 5 woltów procentowym w żelu, który oddziela dwie elektrody.

Wyświetlacz

Kiedy żel działa (gdy próbki przemierzają żel z jednego końca do drugiego), jest on zanurzony w roztworze etydowego bromku (ETBR), barwnika przeplatanego między bazami azotu i tej „marki”, więc więc „marka”, więc Można je wizualizować w transilumenancie za pomocą światła ultrafioletowego.

Do czego służy elektroforeza?

Elektroforeza była historycznie używana z wieloma celami. Dziś jednak jego przydatność zależy w dużej mierze od „pytania”, o które badacz jest pytany w odniesieniu do zjawiska lub określonego systemu, a także od rodzaju elektroforezy, z której chce użyć.

Może ci służyć: topoizomeraza: co to jest, cechy, funkcje, typy

Możemy jednak zaciągnąć niektóre z głównych funkcji, jakie ta technika ma, zaczynając od najbardziej „rzadkich” i kończących się najpopularniejszymi i przeważnie wykorzystywanymi w świecie nauk biologicznych. Elektroforeza jest przydatna:

- Do analizy ilościowej złożonych mieszanin makrocząsteczek i do obliczenia potencjalnej „zeta” (właściwość koloidalna cząstki w ciekłym pożywce pod wpływem statycznego pola elektrycznego).

- Do analizy surowic krwi do celów diagnostycznych.

- Do oddzielenia glukoprotein, lipoprotein i hemoglobiny krwi.

- Do analizy żywności, produktów farmaceutycznych i zanieczyszczeń środowiskowych.

Elektroforeza w żelach agarozowych

- Do oddzielenia fragmentów DNA po trawieniu enzymami ogranicznymi.

- Do oddzielenia cząsteczek kwasu nukleinowego przed przeniesieniem na błony do kolejnych analiz.

- Do analizy produktów PCR (reakcja łańcuchowa polimerazy) weryfikującą, czy wystąpiło, czy nie.

- Dla oszacowania wielkości cząsteczek w mieszaninie DNA lub RNA.

- Do oszacowania ilości i/lub jakości oczyszczonych kwasów nukleinowych.

Elektroforeza w żelach poliakryloamidowych w warunkach denaturalizujących lub natywnych

- Aby określić wielkość białka.

- Zidentyfikować białka.

- Aby określić czystość próbki po kilku etapach oczyszczania.

- W celu zidentyfikowania obecności wewnątrzcząsteczkowych połączeń disiarczkowych.

- Aby określić interakcję między białkami.

- Aby określić punkt izoelektryczny białka.

Fotografia żelu akryloamidowego po przebiegu kilku próbek białka (źródło: larionova.Marina/cc by-sa (https: // creativeCommons.Org/licencje/nabrzeże/4.0) Via Wikimedia Commons)

Czynniki wpływające na elektroforeza

Migracja cząstki w polu elektrycznym zależy od różnych czynników, w tym:

- Twój ładunek elektryczny

- Jego wielkość molekularna

- Jego hydrofobowość i forma

- Wielkość zastosowanego pola elektrycznego

- Zastosowana temperatura systemu i siła jonowa roztworu buforowego

- Charakter środowiska, w którym się znajduje

W odniesieniu do próbki

Wśród parametrów związanych z cząstkami (próbką), które podlegają pola elektrycznego, główne czynniki wpływające na ten proces mają związek z ich obciążeniem, rozmiarem i kształtem.

Im większe obciążenie netto cząstki, tym większa jej szybkość migracji i ta wielkość będzie zależeć od pH. Jednak związek z wielkością jest odwrotnie proporcjonalny, co oznacza, że ​​im bardziej „duża” cząsteczka, tym wolniej migruje.

Może ci służyć: Lia Agar (żelazna lizyna): co to jest, podkład, przygotowanie, użycia

W odniesieniu do pola elektrycznego

Do tej pory rozmawialiśmy o znaczeniu pola elektrycznego w celu osiągnięcia ruchu cząstki przez elektroforeza, ale nie zdefiniowaliśmy tego, co to jest: siła elektryczna na jednostkę obciążenia lub, w prostszym okresie, obszar przestrzeni, w którym istnieje siła elektryczna.

Parametry dotyczące pola elektrycznego, które mogą wpływać na migrację, to napięcie, prąd i opór.

Napięcie wpływa na „czas lotu” cząsteczek oddzielonych po zastosowaniu pola elektrycznego. Im wyższy jest, tym szybszy ruch.

Prąd (ciągłe i jednolite elektronach, które są „popychane” przez źródło napięcia) jest przeprowadzany między elektrodami układu elektroforetycznego dzięki jonom obecnym w roztworze buforowym. Jest bezpośrednio związany z napięciem.

W odniesieniu do roztworu buforowego

Skład, siła jonowa i pH roztworu bufora są głównymi parametrami, które wpływają na elektroforetyczne „bieg”, ponieważ bezpośrednio wpływają na niektóre właściwości próbek, zwłaszcza ładunek elektryczny.

Ponieważ? Roztwór bufora stabilizuje pH pożywki nośnej, w której występuje elektroforeza. Jego skład może wpływać na przesunięcie cząstek migrujących, a także stężenie jonowe, ponieważ jest on bezpośrednio związany z prądem.

W odniesieniu do medium wsparcia

Różne typy i formaty elektroforezy przedstawiają również różne media, na których występuje migracja i gdzie można ją następnie „zarejestrować”.

Szybkość migracji cząsteczek poddanych elektroforezie zależy od rodzaju pożywki nośnej, która zwykle powinna być obojętna.

Jego charakterystyka absorpcji, electroendo-osmoza jest ważna (pojemność ruchu cieczy przez membranę pod wpływem pola elektrycznego) i jego molekularne sito sitowe.

Przykłady zastosowania elektroforezy

Klasyczne przykłady technik elektroforetycznych stosowanych w biologii i biotechnologii obejmują:

- Elektroforeza w żelach agarozowych (angielski Żel elektroforezy)

- Elektroforeza w żelach akryloamidowych w denaturalizujących warunkach (SDS-PAGE, angielski Elektroforeza żelowa dodecylobrylowa sodowa)

- Elektroforeza w żelach akryloamidowych w warunkach rodzimych (BN-PAGE, angielski Blue Native Poliakryloamid Gel Electrroforeis)

- Elektroforeza w dwóch wymiarach (2D-strony, z angielskiego Dwuwymiarowa elektroforeza żelu poliakryloamidowego)

- Elektroforeza kapilarna (z angielskiego Kapilara elektroforezy)

- Isolectroenfoque (angielski Izolowanie)

- Pulsowana elektroforeza pola (angielski Pulsowane elektroforeza pola)

Bibliografia

1. Beck, Kevin. (2020, 25 maja). Rodzaje elektroforezy. Naukowe.com. Pobrano z nauki.com
2. Eseje, Wielka Brytania. (Listopad 2018). Rodzaje i zastosowania elektroforezy. Pobrano z Ukessays.com
3. Nelson, zm. L., Lehninger, a. L., & Cox, m. M. (2008). Zasady biochemii lehninger. Macmillan.
4. Parmar, s. 1. (Sierpień 2018). Elektroforeza: znaczenie, definicja i klasyfikacja (ze schematem). Technologia biologiczna. Pobrano z biotechnologii.com
5. Perrett, zm. (2010). 200 lat elektroforezy. Chromatog. Dzisiaj 4-7.
6. Righetti, s. 1. G. (2005). Elektroforeza: March of Pennies, March of Dimes. Journal of Chromatography A, 1079 (1-2), 24-40.
7. Rilbe, h. (1995). Som Reminisciones of the History of Electrroforeis. Elektroforeza, 16 (1), 1354-1359.
8. Vesterberg lub. (1993). Krótka historia metod elektroforetycznych. Elektroforeza, 14 (1), 1243-1249.
9. Vinayagam, m. (Brak daty). Czynniki wpływające na elektroforeza. Akademia.Edu. Pobrano ze środowiska akademickiego.Edu