Gramowanie

Barwienie Grama jest przydatne do wizualizacji różnych rodzajów bakterii

Co to jest barwienie Grama?

Gramowanie Jest to najprostsza i najbardziej przydatna technika zabarwienia w mikrobiologii diagnostycznej do identyfikacji bakterii. Ta technika została stworzona przez duńskiego doktora Christiana Grama w 1884 r., Który sklasyfikował bakterie w Gram -dodatni (fiolet) i gram -ujemne (różowe), zgodnie ze składem ściany komórkowej.

Technika ta poniosła pewne modyfikacje Huckera w 1921 r. W celu ustabilizowania odczynników i poprawy jakości barwienia, więc barwienie Grama jest również znane jako Gram-Hucker.

Dzięki tej technice jest to również możliwe. A także jego rozkład w przestrzeni: w klastrze, w łańcuchu, izolowanym, w parach, w tetradach itp.

Podstawa

Jest to technika, która przedstawia 4 podstawowe etapy: barwienie, mocowanie z mordantem, przebarwienia i zatrudnianie. Dlatego oprócz kolorowania bakterii pozwala to również je różnicować.

Fiolet Crystal to pierwszy użyty barwnik. To samo ma powinowactwo do peptydoglikanu i zagrtuje wszystkie obecne bakterie, następnie umieścił Lugola, który działa jako mordant, to znaczy indukuje tworzenie nierozpuszczalnych kompleksów fioletowego szkła/jodu/jodu/rybonuklearnego wewnątrz komórki.

Gram -dodatnie bakterie o grubej ścianie peptydoglikanu, tworzą bardziej złożone (fioletowe/jodowe szkło), dlatego będą barwione fioletowe.

Wpływa również na to, że ściana bakterii pozytywnych Grama zawiera więcej bez zaciągniętych kwasów, które wykazują wielkie powinowactwo do środków utleniających (Lubol).

Bakterie Gram -ujemne mają cienki pelerynę peptydoglikanu, co sprawia, że ​​bakterie tworzą się mniej złożone niż Gram -pozytywne.

Następnie pojawia się etap przebarwienia, w których bakterie Gram -dodatnie i Gram -ujemne zachowują się inaczej.

Bakterie Gram -ujemne zawierają błonę zewnętrzną bogatą w lipopolisacharydy, które są częścią ściany komórkowej. Tłuszcze są niszczone przez kontakt z alkoholem acetonowym, więc błona zewnętrzna jest zdestabilizowana, uwalniając fioletowe szkło.

W ten sposób jest później zatrudniony z podstawową safraniną lub fuksiną, przyjmując czerwony kolor.

W przypadku bakterii pozytywnych Grama są one odporne na przebarwie.

Dlatego zabarwienie ze szkłem fioletowym jest stabilne i nie ma miejsca na safraninę lub fuksynę. Dlatego bakterie te są barwione intensywnie lub fioletowe.

Materiały

Zestaw zabarwienia Grama składa się z:

- Fiolet szkło.

- Lugol.

- Alkohol acetonowy.

- Podstawowa safranina lub fuksyna.

Przygotowanie barwników i odczynników

Fioletowy roztwór kryształowy

Rozwiązanie:

Fiolet Crystal - 2 gram

95% - 20 cm3 alkohol etylowy

Rozwiązanie B:

Szczawian amonu - 0.8 gr

Woda destylowana- 80 cm3

W celu ostatecznego przygotowania szklanki fioletowej roztwór do 1:10 należy rozcieńczyć wodą destylowaną i wymieszać z 4 częściami roztworu B. Mieszanina jest przechowywana przez 24 godziny przed jej użyciem. Jest filtrowany w bursztynową butelkę za pomocą filtra papieru.

Może ci służyć: flora i fauna chiapas: reprezentatywne gatunki

Ilość użyta dziennie jest przenoszona do bursztynowej butelki z kroplą.

Jod-lugol

Zważyć i mierzyć wskazaną ilość każdego związku, w następujący sposób:

Kryształy jodu - 1 gram

Potasu joduro - 2 gram

Woda destylowana - 300 cm3

Jodek potasu jest rozpuszczony stopniowo w wodzie, a następnie dodaje się jod. Rozwiązanie butelki bursztynu jest przenoszone.

Zastosowana ilość jest przenoszona do mniejszej bursztynowej butelki z kroplem.

Odrzucone

95% alkoholu etylowe - 50 ml

Aceton - 50 ml

Jest przygotowywany w równych częściach. Dobrze przykryć, ponieważ ma tendencję do odparowania.

Bottero w fut.

To przygotowanie zapewnia umiarkowane przebarwienia czasowe 5-10 sekund., I jest to najbardziej zalecane.

Początkujący wolą używać tylko 95%alkoholu etylowego, gdzie przebarwienia jest wolniejsze, od 10 do 30 sekund.

Podczas gdy najbardziej doświadczony może użyć czystego acetonu, gdzie przebarwienia występuje bardzo szybko od 1 do 5 sekund.

Kontrast

Roztwór matki Safranine

Safranine - 2.5 gr

95%alkoholu etylowe - 100 cm3

Po zważeniu wskazanej ilości safraniny rozpuszcza się przy 100 cm3 alkoholu etylowego na poziomie 95%.

Z roztworu matki przygotowuje się roztwór pracy safraniny.

Aby to zrobić, zmierz 10 cm3 roztworu macierzystego, dodaj 90 cm3 wody destylowanej, aby ukończyć 100 ml.

Zaleca się przenoszenie ilości stosowanej codziennie do bursztynowej butelki z krople.

Mikroorganizmy, które są farbowane słabo z barwieniem Grama-Huckera, jako niektóre beztlenowe, Legionella SP, Campylobacter SP I Brucella sp, Można je zabarwić znacznie lepiej, jeśli modyfikacja dokonana przez Kopeloffa do barwienia gram-huckera, zwana barwieniem Gram-Kopeloff.

Ta technika zmienia barwnik safraniny dla podstawowej fuksyny. Dzięki tej modyfikacji można skutecznie pokolorować wyżej wymienione mikroorganizmy.

Przechowywanie odczynników

Przygotowane barwniki muszą być przechowywane w temperaturze pokojowej.

Przygotowanie rozszerzonej próbki do kolorowania

Próbka musi zawierać co najmniej 10⁵ mikroorganizmy przed jego obserwacją prawdopodobnie w rozmazie. Rozszerzone można przeprowadzić z bezpośredniej próbki lub upraw w środowiskach stałych lub płynnych.

Te rozszerzone muszą być jednolite, dobrze rozłożone i niezbyt grube, aby uzyskać lepszą wizualizację obecnych struktur.

Gram próbek bezpośrednich

Gram moczu bez wirowania

Mocz jest mieszany, a 10 µl umieszcza się na szkiełku. Obserwacja co najmniej jednego pola bakterii/zanurzenia wskazuje, że występuje infekcja.

Oznacza to, że uprawa będzie miała około ponad 100.000 UFC/ML (10⁵ UFC/ml) moczu w 85% przypadków.

Ta metoda nie jest przydatna dla liczby kolonialnych poniżej 100.000 UFC.

Gram CSF

CSF powinien być wirowany, supernatant jest usuwany, a osad rozciąga się na zjeżdżalnię. Ta ciecz jest sterylna w normalnych warunkach. Obserwacja bakterii wskazuje na infekcję.

Może ci podać: gruczoły solne

Gram próbek oddechowych

Sputum gram, mycie oskrzelowe lub brązowe, chociaż może istnieć różne mikroorganizmy, zawsze będzie prowadzić diagnozę, oprócz tego, że jest użyteczny rodzaj zaobserwowanej komórki.

W przypadku ESPUTO należy przygotować rozszerzony z najbardziej ropnymi częściami próbki.

Kał gram

Nie jest wskazane tworzenie Grama do tego typu próbek, ponieważ nie ma on wartości diagnostycznej.

Gram upraw

Można je wykonać na dwa sposoby, jeden z płynnych upraw, a drugi z stałych upraw.

Płynne uprawy

Z płynnych upraw jest niezwykle proste: pod lżejszym pieczeniami mętnego bulionu jest przyjmowane i umieszczane na czystym i suchym slajdzie, dając ruchy okrągłe od środka do peryferii, aby równomiernie rozpowszechniać materiał.

Jest to spontanicznie na emisję. Po wyschnięciu materiał jest przymocowany do arkusza za pomocą ciepła. Aby to zrobić, za pomocą zacisku, który przepuszczasz arkusz 3 do 4 razy przez płomień Bunsen Lżejszy, uważaj, aby nie spalić materiału.

Arkusz może się ochłodzić i umieszczać na mostku kolorystycznym.

Solidne uprawy

Aby wykonać rozszerzone barwienie gramowe z solidnego uprawy, postępuj w następujący sposób:

Przed wybraniem kolonii należy przygotować jagnięcina, umieszczając około dwóch kropli sterylnej fizjologicznej soli fizjologicznej.

Jeśli oryginalna płyta uprawna zawiera kilka rodzajów różnych kolonii, zostanie wybrana izolowana kolonia z nich do wykonania gramu. Każda kolonia zostanie pobrana za pomocą platynowego uchwytu, aby rozpuścić go w roztworze soli fizjologicznej umieszczonej wcześniej na zjeżdżalni.

Ruchy okrągłe są podawane od środka na obrzeże, aby jednorodnie rozpowszechniać kolonię na slajdzie.

Jest to spontanicznie na emisję. Po wyschnięciu arkusz jest przymocowany do ciepła, jak wyjaśniono powyżej (płonąc gniazdo za pomocą zapalniczki), uważając, aby nie spalić materiału.

Ta procedura musi być przeprowadzona z każdym innym rodzajem kolonii. Kolejność tego, co jest obserwowane, na przykład:

Colonia 1: Betahemolityczna żółta kolonia: Gram -dodatnie kokosy zaobserwowano w klastrach.

Colonia 2: Cream Colonia, bez hemolizy: zaobserwowano gramnegatywne kokobakilli.

Każdy arkusz musi być oznaczony, aby wiedzieć, co obserwujemy.

Technika

Technika zabarwienia Grama jest niezwykle prosta do wykonania i stosunkowo ekonomiczna i nie można jej brakować w laboratorium mikrobiologii.

Odbywa się to w następujący sposób:

1. Ustaw rozmaz ciepłem i umieść na moście zabarwienia.
2. Arkusz jest całkowicie pokryty fioletowym szkłem o 1 minutę.
3. Umyj wodą. Nie wysuszyć.
4. Przykryj arkusz roztworem Lugola, pozwól działać przez 1 minutę. Umyj wodą. Nie wysuszyć.
5. Udekoruj 5-10 sekund miękkim alkoholem alkoholu. O Umieść arkusz w pionie i upuść odbarwiające krople na powierzchnię, aż ciągnie zapas fioletowego kryształu. Nie przekracza.
6. Umyj wodą. Nie wysuszyć.
7. Umieść arkusz na mostku kolorowym i przykryj o 30 sekund z safraniną (gram-hucker) lub 1 min z podstawową fuksiną (gram-kopeloff).
8. Umyj wodą.
9. Wypuszczony spontanicznie w powietrzu w pozycji pionowej.

Może ci służyć: flora i fauna

Po wyschnięciu umieść 1 kroplę oleju zanurzenia, aby obserwować go pod celem 100x w mikroskopie optycznym.

Używa/zastosowania barwienia gram

- Ta technika pozwala rozróżnić różnice morfotikalne większości bakterii.

- Drożdże wyróżniają się również tym zabarwieniem. Biorą fioletowe szkło, to znaczy są barwione gram.

- Możesz rozróżnić zarodniki dodatnich z Grama Bacilli, gdzie w Bacillus obserwuje się wyraźną przestrzeń, w której powstała endospora, chociaż zarodniki nie są dobrze poplamione. Do barwienia są stosowane inne techniki, takie jak Shaeffer-Fulton.

- Pomaga określić rodzaj antybiotyku, który należy przygotować.

Należy zauważyć, że to barwienie To nie działa Aby pokolorować wszystkie rodzaje bakterii, to znaczy są przypadki, w których barwienie nie działają.

W takich przypadkach można wymienić bakterie, które nie mają ściany komórkowej. Na przykład: płeć Mycoplasma, sferoplast, Ureaplasma, L formy i protoplasty.

Ponadto bakterie z bakteriami bogate w kwasy mikoli, takie jak prątki i bakterie wewnątrzkomórkowe, takie jak chlamydias i rickettssias.

Nieskuteczne jest również farbowanie większości bakterii spirochemalnych.

Istnieją bakterie tego samego rodzaju, które można zaobserwować w tej samej próbce co Gram -pozytywne i genetyczne. Kiedy tak się dzieje, nazywa się to zmiennym barwieniem gramu, co może być spowodowane zmianami składników odżywczych, temperatury, pH lub stężenia elektrolitu.

Typowe błędy

Udekoruj przesadnie

Wyolbrzymia w przełęczy przebarwienia może powodować obserwację fałszywych mikroorganizmów Grama.

Nie czekaj na wystarczająco dużo czasu na suszenie, aby dodać olej zanurzeniowy

Ten błąd powoduje, że tworzą się tłuszcz miceli, które utrudniają obserwację obecnych struktur. Dzieje się tak, gdy olej dołącza do cząsteczek wody obecnych w zapachu.

Zainwestuj kolejność odczynników

Taki błąd wygeneruje bakterie Gram -ujemne do wizualizacji, to znaczy fałszywie Gram -pozytywnie.

Używaj starych upraw (stałe lub ciecze)

Może powodować, że bakterie pozytywne Grama są barwione gram -ujemne (Gram -ujemne fałsz). Dzieje się tak, ponieważ w starych uprawach jest prawdopodobne, że istnieją martwe lub pogornione bakterie, aw tych warunkach bakterie nie zachowują fioletowego szkła.

Użyj bardzo starego roztworu Lugola

Z czasem Lugol traci swoje właściwości, a jego kolor zanika. Jeśli zastosowano już zdegenerowany odczynnik, nie naprawi to dobrze fioletowego szkła, dlatego istnieje możliwość uzyskania wizualizacji fałszywie gramowych mikroorganizmów.

Niebieskie tło

Odpowiednio przebarwione tło będzie czerwone. Niebieskie tło wskazuje, że przebarwienia było niewystarczające.

Bibliografia

1. HOUSES-RINCÓN, G. (1994). Ogólna mikologia. Central University of Wenezuela.
2. Gramowanie. Zaczerpnięte z niego.Wikipedia.org.
3. González, m., González, n. (2011). Podręcznik mikrobiologii medycznej. Dyrekcja mediów i publikacji University of Carabobo.