Charakterystyka Dapi (4 ', 6-diamidino-2-fenyloindol), fundament, użycie

On Dapi (4 ', 6-diamidino-2-fenyloindol) Jest to barwnik, że dzięki jej właściwości fluorescencyjnej służy między innymi jako marker, szeroko stosowany w technice mikroskopii fluorescencyjnej lub cytometrii przepływowej, między innymi. Fluorescencja, którą emituje, jest jasnoniebieski, jego podniecenie występuje między 455-461 nm (światło UV).

Barwnik DAPI może z łatwością przekraczać błonę komórkową z martwych komórek. Możesz także farbować żywe jądra komórkowe, ale w tym przypadku stężenie tego musi być większe.

Struktura chemiczna dystena. Źródło: Obraz: Plik: DAPI.SVG to wersja wektorowa tego pliku. Należy go używać zamiast tego obrazu rastrowego, gdy nie jest niższy/Richard Wheeler (Zephyris) [CC BY-SA 3.0 (http: // creativeCommons.Org/licencje/by-sa/3.0/)] Edytowany obraz

Barwnik jest w stanie uzyskać dostęp do DNA komórkowego, przez który ma specjalne powinowactwo, łącząc z wielką chęcidnością do podstawy adeniny i tyminy. Z tego powodu jest to bardzo przydatne w niektórych technikach biologii molekularnej.

Ten związek należy do grupy barwników indolowych i wykazał, że ma większą wrażliwość na DNA niż bromek etydyny i jodek propidyny, szczególnie w przypadku żeli agarozowych.

Zastosowanie tego fluorescencyjnego barwnika jest bardzo szerokie, ponieważ jest użyteczne: badanie zmian DNA w procesach apoptotycznych (śmierć komórki), a zatem wykrywanie komórek w tym procesie; do zdjęcia śladu DNA (druk fotograficzny DNA); zbadać zanieczyszczenie bakteryjne; o Aby wizualizować segmentację nuklearną.

Został również zastosowany w badaniu pasm chromosomalnych, w wykrywaniu DNA Mycoplasmas sp, W interakcji DNA-białko, w barwieniu i zliczaniu komórek przez immunofluorescencję, a nawet kolorowanie dojrzałych ziaren pyłku.

[TOC]

Charakterystyka

DAPI to skrót jego nazwy chemicznej (4 ', 6-diamidino-2-fenyloindol). Jego wzór molekularny to C₁₆H_piętnaścieN_5. Ma masę cząsteczkową 350,3. W pobliżu zakresu światła UV (345 do 358 nm) występuje maksymalne wzbudzenie kompleksu DAPI-ADN, podczas gdy maksymalna emisja fluorescencji występuje między 455-461 nm.

Ten barwnik charakteryzuje się byciem żółtym pyłem, ale struktury oznaczone tym fluoroforem emitują jasnoniebieskie światło.

Jest to jednak związek rozpuszczalny w wodzie w celu przyspieszenia jego rozpuszczania, niektóre ciepło można zastosować. Można go rozcieńczyć PBS, ale nie rozpuszczać się bezpośrednio w tym.

Może ci służyć: kwas arsenioso (H3SO3): właściwości, ryzyko i zastosowania

Po przygotowaniu barwnika musi być przechowywany w ciemności, to znaczy chroniony przed światłem, w temperaturze od 2 do 8 ° C (lodówka). W tych warunkach barwnik jest stabilny przez ponad 3 tygodnie lub miesiące.

Jeśli światło jest chronione, ale jego stabilność jest pozostawiona w temperaturze pokojowej do 2 lub 3 tygodni, ale narażone na bezpośrednie światło pogorszenie jest bardzo szybkie. Jeśli chcesz zaoszczędzić na znacznie dłużej, możesz przechowywać w lodówce w temperaturze -20 ° C rozłożone na porcjach.

Podstawa

To zabarwienie opiera się na generowaniu zatrudniania jądrowego w głównych technikach biologii molekularnej, takich jak: cytometria przepływowa, mikroskopia fluorescencyjna i barwienie metafazowych chromosomów lub jąder interfejsu, między innymi.

Ta technika opiera się na wielkim powinowactwie, jakim ma barwnik dla zasad azotowych (adenina i timina) zawartych w materiale genetycznym (DNA) w niewielkim rowku. Podczas gdy na poziomie cytoplazmatycznym pozostawia bardzo mało dna.

Kiedy następuje połączenie barwnika fluorescencyjnego do regionów adeniny i Timiny DNA, fluorescencja znacznie wzrasta (20 razy więcej). Kolor, który emituje, jest jasnoniebieski. Należy zauważyć, że nie ma emisji fluorescencji podczas wiązania z parami zasad GC (guanina-cytozyna).

Należy podkreślić, że chociaż ma również powinowactwo do RNA, nie powoduje problemu, ponieważ większy stopień emisji energii tej cząsteczki występuje na innej długości fali (500 nm), w przeciwieństwie do DNA, który robi to do 460 nm. Ponadto wzrost fluorescencji po powiązaniu z RNA wynosi tylko 20%.

DAPI jest używane bardziej do barwnika martwych (ustalonych) komórek, które żyjesz, ponieważ aby farbować to ostatnie, potrzebne jest znacznie wyższe stężenie barwnika, dzieje się tak, ponieważ błona komórkowa jest znacznie mniej przepuszczalna dla DAPI, gdy żyje.

Barwnik DAPI może być stosowany w połączeniu z czerwonymi i zielonymi fluoroforami w celu uzyskania wielokolorowych wrażeń.

Używać

DAPI (4 ', 6-diamidino-2-fenyloindol) jest doskonałym fluoroforem i dlatego jest szeroko stosowany w różnych technikach i do różnych celów. Zastosowanie DAPI jest wyjaśnione poniżej w głównych technikach.

Cytometrii przepływowej

Naukowcy Gohde, Schumann i Zante w 1978 roku byli pierwszymi i zaproponowali DAPI jako fluoroforu w technice cytometrii przepływowej, odnosząc wielki sukces ze względu na ich wysoką wrażliwość przez DNA i wysoką intensywność w emisji fluorescencji.

Może ci służyć: grupa aminowa (NH2): struktura, właściwości, przykłady

Zastosowanie DAPI w tej technice umożliwia badanie cyklu komórkowego, kwantyfikację komórek i barwienie żywych i martwych komórek.

Chociaż istnieją inne barwniki, takie jak bromek etydyny, tlenek hoechst, pomarańczowy akrydyna i joddio propidio, DAPI jest jednym z najczęściej używanych do bycia bardziej możliwym do fotoestantów niż te wspomniane powyżej.

W przypadku tej techniki jest to konieczne. Próbka jest odwirowana, a supernatant jest odrzucony.

Podczas gdy czas mija barwnik DAPI z buforem do barwienia (Foxp3 z Biolegend) do 3 µm.

Odwiruj próbkę, odrzuć supernatant, a następnie przykryj 1 ml roztworu DAPI przez 15 minut w temperaturze pokojowej.

Weź próbkę do cytometru przepływowego z prawym laserem.

Mikrofluorometria przepływu

Inną techniką, w której stosuje się DAPI, jest mikro-fluorometria przepływu wraz z innym fluoroforem zwanym mitramicznym. Oba są przydatne do kwantyfikacji.

Hybrydyzacja In situ 

Ta technika zasadniczo wykorzystuje sondy DNA oznaczone fluorescencyjnym barwnikiem, którym może być DAPI.

Próbka wymaga obróbki ciepła w celu denaturalizacji dwumleklasy DNA i przekształcenia go w dwa łańcuchy monokiesowe. Następnie jest hybrydyzowany z DNAzed DNA sonda oznaczoną DAPI, która ma sekwencję zainteresowania.

Następnie jest myte w celu wyeliminowania tego, co nie było hibrid, do wizualizacji DNA stosuje się kontrast. Mikroskop fluorescencyjny umożliwia obserwację hybrydyzowanej sondy.

Ta technika ma na celu wykrywanie określonych sekwencji w chromosomalnym DNA, możliwość diagnozowania niektórych chorób.

Te techniki cytrowcząsteczkowe były pomocne w określeniu szczegółów w badaniu kariotypów. Na przykład udowodniło, że regiony bogate w pary podstawy adenozyny i tyminy zwane regionami heterochromatycznymi lub pasmami DAPI.

Może ci służyć: przepuszczalność: koncepcja, jednostki, czynniki, przykłady

Ta technika jest szeroko stosowana do badania chromosomów i chromatyny u roślin i zwierząt, a także w diagnozowaniu patologii prenatalnych i hematologicznych u ludzi.

W tej technice zalecane stężenie DAPI wynosi 150 ng/ml przez 15 minut.

Już zamontowane szkiełka powinny być chronione przed światłem w 2-8 ° C.

Barwienie immunofluorescencji

Komórki są ustalane 4% paraformaldehydem. Jeśli będą używane inne barwniki, DAPI pozostaje na końcu jako zatrudnienie, a komórki z roztworem PBS przez 15 minut są pokryte. Podczas gdy upływa czas, przygotuj rozcieńczenie roztworu DAPI PBS, tak że końcowe stężenie wynosi 300 µm.

Następnie nadmiar PBS jest ekstrahowany i pokryty DAPI przez 5 minut. Umyj kilka razy. Arkusz obserwuje się w mikroskopie fluorescencyjnym pod właściwym filtrem.

Arkusz bezpieczeństwa

Ten związek musi być starannie manipulowany, ponieważ jest to związek, który ma właściwości mutagenne. Węgiel aktywowany jest stosowany do wyeliminowania tego związku roztworów wodnych, które zostaną odrzucone.

Należy użyć rękawiczek, szaty i soczewek bezpieczeństwa, aby uniknąć wypadków z tym odczynnikiem. Jeśli nastąpi kontakt kontaktowy lub śluzowy, należy umyć obszar wystarczającą ilością wody.

Nigdy nie powinieneś rurkować o tym odczynniku ustami, używać propipetów.

Nie zanieczyszczaj odczynnika czynnikami drobnoustrojami, ponieważ spowoduje to błędne wyniki.

Nie rozcieńcz barwnika DAPI bardziej niż zalecane, ponieważ jakość barwienia znacznie spadnie.

Nie narażaj odczynnika na bezpośrednie światło lub zachowaj ciepło, ponieważ zmniejsza fluorescencję.

Bibliografia

1. Brammer S, Toniazzo C i Poersch L. Powszechnie przedsiębiorcy cholars na cytogenetyka warzyw. ARQ. Inst. Biol. 2015, 82. Dostępne od: Scielo.
2. Impath Laboratories. Dapi. Dostępne na: MenarInidiagnostics.com/
3. Laboratoria Cytocell. 2019. Instrukcje dotyczące korzystania z DAPI. Dostępne w Cycell.com
4. Elaosegi A, Sabater S. Pojęcia i techniki w ekologii rzek. (2009). Redakowe rubes, Hiszpania. Dostępne na: książki.Google.współ.Iść/
5. Novaes R, Penitent A, Talvani A, Natali A, Neves C, Maldonado I. Zastosowanie fluorescencji w zmodyfikowanej metodzie Dessector w celu oszacowania liczby miocytów w tkance serca. ARQ. Staniki. Cardiol. 2012; 98 (3): 252-258. Dostępne od: Scielo.
6. Rojas-Martínez R, Zavaleta-Mejía E, Rivas-Valencia P. Obecność fitoplasmas w Papayo (Carica Papaya) w Meksyku. Magazyn Chapingo. Seria ogrodnictwa, 2011; 17 (1), 47-50. Dostępne na: Scielo.org.