Fundacja Half Löwenstein-Jensen, przygotowanie i użycie

On Middle Löwenstein-Jensen Jest to selektywne solidne pożywkę do izolacji i rozwoju bakterii z rodzaju Mycobacterium, takiego jak Prątek gruźlicy, M. Avium, między innymi, z wyjątkiem gatunków Leprae, które nie można uprawne.

Bakterie z rodzaju Mycobacterium nie rosną w konwencjonalnych pożywkach hodowlanych, dlatego konieczne było zaprojektowanie specjalnego środka do jego izolacji. Oryginalne medium zostało utworzone przez Löwensteina, a następnie zmodyfikowane przez Jensena.

Pół Löwenstein-Jensen z kolonią Mycobacterium tuberculosis. Źródło: Agarwal i in. / Biomed Central Ltd., Dzięki uprzejmości biologii biologii

Modyfikacja polegała na wyeliminowaniu barwnika Czerwonego Konga, zastępując go w celu większego stężenia zielonego malachite. Zmieniło również stężenia cytrynianu magnezu i fosforanu monopotazowego.

Położenie linöwensteina zawiera obecnie skrobię papate, asparragin, cytrynian magnetyczny, fosforan monopo-fazowy, siarczan magnetyczny, zielony malachite, kwas nalidíxico, cykloheksyd.

Mycobacteria jest zwykle izolowane od miejsc, które nie są sterylne, takie jak plwocina, mocz, ropnie, między innymi. Oznacza to, że większość próbek będzie zawierać zwykłą mikroflorę tego obszaru, a także patogen.

Właśnie dlatego pożywka Löwenstein-Jensen zawiera serię inhibitorów w jego składzie reprezentowanym przez malachite zielony, antybiotyki i przeciwgrzybicze.

Ponadto próbki pochodzące z miejsca niesterylnego muszą być odkażone i zneutralizowane przed wysią w medium Löwenstein-Jensen.

[TOC]

Podstawa

Obecność jaja i gliceryny w pożywce Löwenstein-Jensen stymuluje wzrost prątków, ponieważ zapewniają one kwasy tłuszczowe i białka niezbędne do rozwoju tych mikroorganizmów.

Medium Löwenstein-Jensen zawiera Malachite Green, który jest towarzyszącym inhibitorem mikroflory. Ale zawiera także kwas nalidícsyczny (35 µg/ml), który hamuje mikrobio ujemne Grama, cykloheksyd (400 µg/ml), który hamuje grzyby saprofitów i drożdże, oraz linczowanie (2µ/ml), które hamuje mikrobiota gramowo dodatni pozytywnie.

Niektóre domy komercyjne wolą dodawać następującą kombinację antybiotyków: Polymixina B 200.000 jednostek/L, amfoterycyna B 10 mg/L, karbenicylina 50 mg/L i Trimetoprima 10 mg/L.

Ta medium nie zawiera agaru, dlatego zestalenie pożywki występuje przez koagulację albuminy obecnej w jaju podczas sterylizacji.

Przygotowanie

Waż 37,3 g odwodnionej pożywki w 600 ml wody destylowanej, która wcześniej dodano 12 ml glicerolu. Mieszanina jest podgrzewana, często mieszając aż do całkowitego rozwiązania. Autoclavar Medium w 121 ° C przez 15 minut.

Może ci służyć: 12 etapów rozwoju człowieka i jego cechy

Z drugiej strony należy przygotować jednorodne zawieszenie 1000 ml świeżych jaj w warunkach aseptycznych. Dodaj zawieszenie jaja przy 600 ml przygotowanych w temperaturze 50–60 ° C, unikając pęcherzyków powietrza.

Roztwory antybiotykowe są również dodawane po sterylizacji w autoklawie.

Wlej medium do sterylnych rur testowych za pomocą wtyczki gwintu. Podgrzej rurki w 85 ° C przez 45 minut w położeniu.

Kolor przygotowanego pożywki to zielona aguamaryna i może przedstawić białawe punkty dla obecności lipidów jajowych.

Średnie pH musi wynosić 7,2 ± 0,2

Zapisz lodówki i chronione przed bezpośrednim światłem do użycia. Zlew przed siewem.

Istnieje modyfikacja medium o nazwie „Gruft modyfikacja Löwensteina Jensena”. Zawiera te same związki, co klasyczny pożywkę, ale dodaje się RNA-5MG/100 ml, a jako inhibitory zawierają malachite zielony 0,025 g/100 ml, penicylinę 50 U/ml i Nalidíxico 35 ug/ml kwasu kwasu.

Aplikacje

Medium Löwenstein-Jensen jest używane do izolacji Mycobacteria, z różnych rodzajów próbek. Zaleca się wykonanie barwienia Ziehl-Neelsen do dowolnej próbki, w której podejrzewa się obecność prątków.

Niektóre próbki pochodzą z sterylnych miejsc, ale inne nie. Próbki niesterylowe muszą być odkażone w zależności od przypadku:

Plwocina

Próbki plwociny muszą być odkażone w następujący sposób: Określ ilość próbki plwociny w ml i dodaj do tej samej ilości 4% NaOH i najeżdżającego do 37 ° C.

Często wstrząśnij mieszaniną w ciągu 30 minut. Następnie odśrodki przy 3000 obr / min przez 30 minut.

Odrzuć supernatant na fenolowym roztworze dezynfekującym. Użyj osadu siewnego, ale najpierw pH musi zostać zneutralizowane.

Do zneutralizowania osadu, jest używane H₂południowy zachód₄ przy 5% w obecności czerwonego wskaźnika fenolu, dopóki nie doprowadzi do neutralnego pH, który powstaje w kolorze łososia.

Mycie żołądka, mycie oskrzelowe i aspiracja oskrzelowa

W takim przypadku próbka powinna być odwirowana przy 3000 obr / min przez 30 minut. Supernatant jest odrzucany i używany jest osad. Aby odkaczyć osad, dodaje się 3 ml 4% NaOH i często miesza się w 37 ° C przez okres pół godziny.

Może ci służyć: Stroma (histologia)

Wirówka ponownie, supernatant jest odrzucony i używany jest osad. Ten ostatni musi zostać zneutralizowany, jak wyjaśniono w próbce plwociny.

Mocz

Pozwól próbce w lodówce na 24 godziny. Oddziel supernatant. Pozostały osad musi być wirowany przez 30 minut przy 3000 RMP. Odrzuć ponownie supernatant i odtworz osad 3 ml sterylnego roztworu fizjologicznego.

Dodaj 3 ml 4% NaOH i przejdź do odkażania i neutralizacji, jak opisano wcześniej.

Płyn puchletowy, płyn opłucnowy, płyn mózgowo -rdzeniowy

W tego rodzaju próbce jest to odwirowane, a supernatant jest odrzucany. Zrób gram osadu lub obserwuj bezpośrednio w mikroskopie; Jeśli bakterie nie są obserwowane, przejście odkażania nie jest konieczne i ani neutralizacja.

W takim przypadku próbkę można zasiewać bezpośrednio za pomocą osadu. Jeśli istnieją bakterie, przejdź do odkażania i zneutralizowania, jak opisano powyżej.

Biopsje

Ten typ próbki należy dodać 5 ml wody destylowanej do późniejszej wirowania przy 1500 obr / min przez 10 minut. Odrzuć supernatant i odwiruj osad przy 3500 obr / min przez 30 minut. Użyj osadu, aby zasnąć medium hodowlane.

Hiophare krtani

Wymaz należy wprowadzić do sterylnej rurki zawierającej równe części wody destylowanej i 4% NaOH. Wacik należy naciskać na ściany rurki, aby próbka była rozcieńczona w cieczy. Odśrodkowe i używaj osadów. Zneutralizuj osad, jak już opisano.

Posiany

Media Löwenstein-Jensen są zaszczepione przez dodanie 0,5 ml próbki na powierzchni pożywki. Obróć rurkę, aby rozłożyć próbkę w całym medium. Nie noś platynowego uchwytu.

Możesz zasiewać drugą rurkę zawierającą pół kamienną w celu izolacji Mycobacterium bovis i inne gatunki, które nie rosną w środowisku Löwenstein-Jensen.

Inkubacja

Zaszczepione rurki inkubuje się w aerobiozie w 37 ° C, z lekko leniwą pokrywką i nachyloną w około 5 ° i chronione przed światłem. Środowisko z dwutlenkiem węgla można wzbogacić na 5-10%. Sprawdź uprawy dwa razy w tygodniu, aż do pojawienia się kolonii.

Może ci służyć: emudycie nosowe: do czego służy, procedura, uprawa

Gdy próbka została wchłonięta, tapas są regulowane. Maksymalny czas inkubacji wynosi 8 tygodni, jeśli po tym czasie nie doszło do wzrostu jako ujemnego.

QA

Jako kontrola jakości możesz użyć następujących szczepów:

Prątek gruźlicy ATCC 27294,  Mycobacterium kansasii ATCC 12478, Mycobacterium avium ATCC 19291, Mycobacterium bovis ATCC 19219, Mycobacterium fortuitum ATCC 6841, Escherichia coli ATCC 25922, Streptococcus pyogenes ATCC 19615, Cryptococcus neoformans ATCC 32045

W przypadku pierwszych wymienionych gatunków oczekuje się doskonałego rozwoju, aby M. Fortuitum Wzrost musi być dobry, podczas gdy dla M. Bovis Oczekuje się rzadkiego lub zerowego wzrostu. Podczas gdy gatunki inne niż rodzaj Mycobacterium muszą być całkowicie zahamowane.

Ograniczenia

Przygotowane medium musi chronić się przed światłem, przedłużona ekspozycja na światło powoduje, że medium od zielonego do niebieskiego, w tym przypadku medium nie można już używać. Jest tak, ponieważ zieleń Malachite jest światłoczula.

Medium, ponieważ zawiera jajo, może być łatwo zanieczyszczone, jeśli nie jest manipulowane aseptycznie. Można go rozpuścić, jeśli jest zanieczyszczony bakteriami proteolitycznymi.

Uprawa i manipulacja bakteriami z rodzaju Mycobacterium wymaga wykwalifikowanego personelu, który jest świadomy środków bezpieczeństwa biologicznego, które należy spełnić, aby uniknąć zanieczyszczenia lub zanieczyszczenia innych.

HCl nie należy stosować w przejściu neutralizacji z powodu tworzenia chlorku sodu, który może być toksyczny dla Kocha Bacillus.

Próbki muszą być przechowywane w lodówce i chronione przed światłem, o ile nie są przetwarzane.

Odniesienie

1. Laboratories Francisco Soria Melguizo. 2009. Medium selektywne Löwenstein-Jensen. Dostępne na: F-Soria.Jest
2. Britania Laboratories. 2017. Medium Löwenstein-Jensen. Dostępne na: Britanialab.com.
3. Neogen Laboratories. Medium Löwenstein-Jensen. Dostępne na: Foodsafety.Neogen.com.
4. „Środek Löwenstein-Jensen." Wikipedia, bezpłatna encyklopedia. 20 listopada 2018, 15:15 UTC. 24 kwietnia 2019, 18:34. Wikipedia.org
5. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Diagnoza mikrobiologiczna. Ed. Pan -american Editorial S.DO. Argentyna.
6. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Diagnoza mikrobiologiczna Bailey & Scott. 12 ed. Pan -american Editorial S.DO. Argentyna.
7. Mac Faddin J. (2003). Testy biochemiczne identyfikacji bakterii znaczenia klinicznego. Wydanie trzecie. Pan -american Editorial. Buenos Aires. Argentyna.