Techniczne rekombinowane DNA, zastosowania i podstawy

On Rekombinowane DNA (DNA lub rDNA) to sztuczna cząsteczka kwasu nukleinowego utworzona w laboratorium, poprzez zintegrowanie dwóch interesujących segmentów organizmów. Jest również znany jako chimeryczny DNA, dzięki swojej właściwości hybrydowej. Nie znajdujemy tego rodzaju DNA w naturze.

Podstawowa metodologia jej generowania obejmuje: (a) wybór białego DNA i jego wstawienie do innego fragmentu DNA (ogólnie plazmid bakteryjny); (b) Wprowadzenie tego plazmidu do bakterii (c) wybór bakterii przez antybiotyki i wreszcie (d) ekspresja genu.

Źródło: Pixabay.com

Technika wykorzystuje grę enzymatyczną, która pozwala kopiować i wkleić określone fragmenty DNA do badania naukowca.

Celem technologii rekombinowanej jest w większości przypadków ekspresja białka (znanego jako rekombinowane białko) pożądanego przez biologa molekularnego do przyszłych badań lub do stworzenia białka o wartości komercyjnej i terapeutycznej - na przykład insuliny ludzkiej, na przykład insuliny ludzkiej, na przykład insuliny ludzkiej, na przykład insuliny ludzkiej insuliny, ludzkiej insuliny.

[TOC]

Podstawy rekombinowanej techniki DNA i jej zastosowanie w inżynierii genetycznej

Centralny dogmat biologii molekularnej

Wszystkie istoty organiczne, które znamy, mają kilka cech. Jednym z nich jest natura materiału genetycznego i sposób wytwarzania białek - proces znany jako centralny „dogmat” biologii molekularnej.

Z wyjątkiem pary wirusów, wszystkie organizmy przechowują informacje genetyczne w DNA (kwas deoksyrybonukleinowy), zebrane bardzo zwarte i zorganizowane w jądrze komórkowym.

W przypadku ekspresji genów cząsteczka DNA jest transkrybowana do posłańca RNA, a ten ostatni jest tłumaczony na język aminokwasowy, strukturalne bloki białek.

Co to jest rekombinowane DNA?

W latach 70. i 80. biolodzy molekularne zaczęli korzystać z procesów, które naturalnie występują w komórce i udało się ekstrapolować je do laboratorium.

W ten sposób gen zwierzęcy (na przykład kręgowca) można było wstawiać do segmentu DNA z bakterii; lub DNA bakterii można połączyć z wirusowym DNA. Zatem możemy zdefiniować rekombinowany DNA jako cząsteczkę złożoną z DNA z dwóch różnych organizmów.

Po utworzeniu tej hybrydowej lub rekombinowanej cząsteczki przechodzimy do ekspresji genu zainteresowania. Słowem wyrażenie Chcemy odnosić się do procesu translacji białka.

Może ci służyć: Monohíbrid

Enzymy ograniczenia i lig: klucz do procesu

Kluczowym elementem opracowania rekombinowanej technologii DNA było odkrycie enzymów restrykcyjnych.

Są to cząsteczki białkowe, które wykazują zdolność dzielenia na DNA (nukleas) w sekwencjach betonowych, służąc jako „nożyczki molekularne”. Fragmenty wygenerowane przez te enzymy nazywane są fragmentami restrykcyjnymi.

Te enzymy mogą wytwarzać w symetrycznych cięciach sekwencji białej (w obu łańcuchach na tej samej wysokości) lub asymetryczne cięcia. Kluczowym aspektem działania enzymów restrykcyjnych jest to, że po podzieleniu łańcuchów uzyskano „luźną krawędź”, uzupełniającą się do drugiej krawędzi wyciętej przez ten sam enzym.

Niektóre przykłady to ECOR 1 i SMA 1. Obecnie znanych jest ponad 200 rodzajów enzymów restrykcyjnych i są one dostępne w handlu.

Aby być przydatnym, nożyczkom musi towarzyszyć klej. To działanie uszczelniające DNA (wcześniej traktowane enzymami ogranicznymi) jest przeprowadzane przez ligi.

Technika: W jaki sposób DNA organizmu w laboratoryjnej zmodyfikowanej sztucznie?

Następnie opiszemy główne kroki wymagane przez rekombinowaną technologię DNA. Wszystkie są przeprowadzane przez profesjonalistów w laboratorium biologii molekularnej.

Co to jest „klon”?

Przed kontynuowaniem protokołu eksperymentalnego musimy zauważyć, że w biologii molekularnej i biotechnologii termin „klon” i czasownik „klonar” jest szeroko stosowany. To może prowadzić do zamieszania.

W tym kontekście nie odnosimy się do klonowania Wszystko organizm (jak na przykład w przypadku słynnej owcy Dolly), ale do klonowania fragmentu DNA, który może być genem. To znaczy, wytwarzaj wiele kopii - genetycznie identycznych - sekwencji.

1. Izolacja i uzyskanie DNA

Pierwszym krokiem jest podjęcie decyzji, która sekwencja chce użyć. To zależy całkowicie od badacza i celów jego pracy. Następnie ten DNA musi być izolowany i oczyszczony. Metody i procedury do osiągnięcia tego zależą od organizmu i tkanki.

Część tkanki jest na ogół przyjmowana i poddana leczeniu w buflu lizy. Następnie postępuje fragmentacja materiału genetycznego w małych fragmentach.

2. Wektor klonowania

Po etapach przygotowawczych badacz stara się wprowadzić segment DNA zainteresowania w wektorze klonującym. Od teraz do tego segmentu DNA nazwiemy to białym DNA.

Może ci służyć: gen dominujący: zasady genetyczne, metody badania, czynniki

Plazmidy

Jeden z najczęściej używanych wektorów w plazmidzie pochodzenia bakteryjnego. Plazmid to okrągła cząsteczka DNA podwójnego kina, którą znajdujemy naturalnie w bakteriach. Są bytami poza chromosomem bakteryjnym - to znaczy są pozakromosomalne i naturalnie znajdują się w tych prokariotach.

Podstawowymi elementami wektora to: (a) pochodzenie replikacji, które umożliwia synteza DNA; (b) środek selekcyjny, który umożliwia identyfikację organizmów przenoszących plazmid z białym DNA, takie jak odporność na antybiotyk; oraz (c) Miejsce wieloklasowa.

Pierwszy udany rekombinowany DNA w laboratorium sklonowano w plazmidzie PSC101 z bakterii I. coli. Zawiera miejsce restrykcyjne enzymu restrykcyjnego ECORI i gen oporności na antybiotyk, oprócz pochodzenia replikacji.

Wstawienie białego DNA w plazmidzie odbywa się przy użyciu narzędzi molekularnych enzymów i lig ograniczeń opisanych w poprzednim rozdziale.

Podsumowują typy wektorów

Oprócz plazmidów DNA można wstawić do innego wektora, takiego jak bakteriofag Lambda.

3. Wprowadzenie rekombinowanego DNA

Po uzyskaniu rekombinowanej cząsteczki DNA (gen zainteresowania plazmidu lub innego wektora).

Aby wprowadzić obce DNA w bakterii, stosuje się technikę zwaną transformacją bakteryjną, w której ciało poddane jest leczenie z białkowymi kationami, które sprawia, że ​​jest podatne na przyjmowanie DNA.

Metodologicznie nie możemy zapewnić, że 100% bakterii w naszych uprawach skutecznie wzięło naszą rekombinowaną cząsteczkę DNA. W tym miejscu wchodzi część plazmidu zawierającego oporność na antybiotyki.

Zatem bakterie, które wzięły plazmid, będą odporne na określony antybiotyk. Aby je wybrać, wystarczy zastosowanie wspomnianego antybiotyku i zabierze ocalałych.

4. Białko „żniwa”

Po wybraniu bakterii z naszym rekombinowanym DNA, przystępujemy do używania maszyny enzymatycznej gospodarza, aby wygenerować przedmiotowy produkt białkowy. Gdy bakterie są odtwarzane, plazmid przechodzi do swojego potomstwa, więc nie jest tracony podczas podziału.

Ta procedura wykorzystuje bakterie jako rodzaj „fabryki” białka. Później zobaczymy, że była to bardzo istotna procedura w opracowywaniu skutecznego leczenia.

Może ci służyć: telofaza: czym jest w mitozie, w mejozie

Gdy uprawa będzie gotowa i bakterie wytwarzają duże ilości białek, komórka lub pęknięcie komórki jest. Istnieje szeroki zakres technik biochemicznych, które umożliwiają oczyszczenie białka według ich cech fizycznych chemicznych.

W innym kontekście eksperymentalnym możemy nie być zainteresowani generowaniem białka, ale jesteśmy zainteresowani uzyskaniem sekwencji DNA jako taki. Gdyby tak było, plazmid służyłby do tworzenia wielu kopii fragmentu, który nas interesuje w celu posiadania wystarczającej ilości białego DNA do przeprowadzenia odpowiednich eksperymentów.

Aplikacje

Rekombinowana technologia DNA otworzyła nieskończoną liczbę możliwości biologii molekularnej, biotechnologii, medycyny i innych powiązanych obszarów. Twoje najwybitniejsze aplikacje są następujące.

Analiza genetyczna

Pierwsze zastosowanie jest bezpośrednio związane z laboratoriami biologii molekularnej. Rekombinowana technologia DNA pozwala badaczom zrozumieć normalną funkcję genów, a wygenerowane białka można zastosować w kolejnych badaniach.

Przemysł farmaceutyczny

Białka wytwarzane za pomocą rekombinowanej procedury DNA mają zastosowanie w medycynie. Dwa bardzo istotne przykłady w terenie to ludzka insulina i hormon wzrostu, który jest stosowany u pacjentów bez takiego białka.

Dzięki rekombinowanemu DNA białka te można wygenerować bez potrzeby ekstrakcji z innego człowieka, co reprezentuje dodatkowe powikłania metodologiczne i ryzyko zdrowotne. Pomogło to poprawić jakość życia niezliczonych pacjentów.

Bibliografia

1. Baca, L. I. L., & Álvarez, c. L. C. (2015). Biologia 2. Grupa redakcyjna Patria.
2. Cooper, g. M., Hausman, r. I., & Hausman, r. I. (2000). Komórka: podejście molekularne (Tom. 10). Waszyngton, DC: ASM Press.
3. Devlin, t. M. (2004). Biochemia: podręcznik z aplikacjami klinicznymi. Odwróciłem się.
4. Khan, s., Ullah, m. W., Siddique, r., Nabi, g., Manan, s., Yousaf, m., & Hou, h. (2016). Rola rekombinowanej technologii DNA w celu poprawy życia. International Journal of Genomics, 2016, 2405954.
5. Mindan, f. P., & Mindan, p. (1996). Anatomia patologiczna. Elsevier Hiszpania.
6. Tortora, g. J., Funke, ur. R., & Case, c. L. (2007). Wprowadzenie do mikrobiologii. Wyd. Pan -american Medical.
7. Ich. J. (1989). Ludzka insulina: pierwszy lek DNA Technology. American Journal of Health-System Pharmacy, 46(11_suppl), S9-S11.